LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA (MBI-013)

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA (MBI-013)
Paraf:	Nama: NURUL BADRIAH	Nilai:
	Hari/tanggal percobaan: Sabtu / 27 November 2010 Kelompok: 3 (Tiga)
PERCOBAAN VIII

Judul: EKSTRAKSI DNA, POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) DAN ELEKTROFORESIS GEL

Tujuan: · Mengetahui proses preparasi sampel, penggunaan PCR, proses preparasi gel dan penggunaan elektroforesis gel.

Analisis dan Pembahasan:

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample (Sutomo, 2002).

            Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1.      Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.

2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60 °C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.

3.      Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial (Prasetyoputri, 2005).  

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis) (Jusuf, 2001).

Pada percobaan ini menjelaskan tentang tahapan dalam ekstraksi DNA yang menyebabkan serangkaian reagen dan enzim yang memungkinkan DNA terpisah dari sel. Hasil dari ekstraksi DNA digunakan untuk PCR (Polymerase Chain Reaktion) tahapan ini digunakan untuk mengetahui banyaknya jumlah DNA yang dapat tersalin dalam penurunan keturunan. Dalam proses in juga terjadinya denaturasi, pelekatan dan polimerasi. Satu-satu menjelaskan denaturasi adalah pembagian DNA dari rantai ganda menjadi rantai tunggal yang dilakukan menggunakan siklus suhu, saat polimerasi, primer melekat pada rangkain DNA tunggal pada setiap ujungnya suhu menjadi turun, sehingga pada saat itu juga terjadinya pemanjangan DNA sehingga suhu menjadi naik.

Tahap-tahap kerja:

Macam Percobaan	Perlakuan	Hasil
Ekstraksi DNA ·         Tes genetik (Kekerabatan) Identifikasi tubuh Memecahkan sel ·         Mengambil sampel	1.      Mengambil sampel Memecahkan sel, memisahkan DNA, mengkosentrasikan DNA. Sampel dimasukan kedalam tabung evenlook + larutan lisis diinkubasi. 2.      Hasil perlakuan 1 + larutan buffer + larutan garam disentrifius + larutan alkohol isotrofil di kocok  disentrifius.	Menjadi larutan intergel, Sel pecah dan DNA keluar dari dalam sel, dan DNA terpisah. Terjadi penguapan, kotoran pada DNA mengambang, semua protein mengendap (pellet)  DNA akan terkosentrasi Adanya benang-benang 5.      DNA terdapat di pellet.
PCR (Polymerase Chain Reaction)	Hasil ekstraksi DNA dimasukan kedalam tabung 20 mikron (1 ½ ml)/ 20 mikron + DNTP + enzim polimergel + MgCl2 dimaskan kedalam pengsiklus suhu Terlibatnya enzim	Terdenaturasi pada suhu 950C Terjadi penurunan suhu saat terjadi denaturasi Saat primer melekat polimerasi suhu naik 750C 4.      Terjadi hingga 30 siklus > 100 juta segmen pasangan DNA
Gel Elekroforesis ·         Untuk memeisahkan potongan DNA berdasarkan DNAnya	1.      Membuat agar Tabung erlenmeyer di masukan larutan buffer 100 ml di microwave beberapa saat di masukan kedalam cetakan di pasang sisir pada salah satu ujung cetakan untuk membuat sumur ditunggu sampai larutan agarnya mengeras angkat sisir. Dimasukan lodingbuaffer pada salah satu ujung sumur, dimasukan sampel pada sumur samping loding buafer. Di cuci dengan etium bromida. Pada setiap ujung dihubungkan aliran listrik. Di diamkan selama 1 ½ jam	Terjadinya pemadatan pada larutan buffer menjadi agar. DNA yang di inginkan akan terwarnai. Dapat dilihat banyaknya jumlah DNA yang diinginkan.

Reagen-reagen yang digunakan dalam isolasi DNA adalah larutan lysis yang mengandung 2 komponen penting (larutan detergen dan enzim proteinase yang berfungsi untuk menghancurkan protein), larutan buffer yang berfungsi untuk memisahkan DNA dari protein, dan alkohol (isopropil alkohol) yang berfungsi untuk mengkonsentrasi larutan.

Reagen-reagen yang dibutuhkan dalam PCR adalah larutan buffer yang berfungsi untuk memindahkan DNA dari protein dan MgCl₂ yang berfungsi untuk pewarnaan.

Pada elektroforesis gel, alat dan bahan yang digunakan adalah agarose, erlenmeyer, cetakan DNA, sisir gel, buffer (untuk membuat sumur), pemanas, etidium bromida, sumur, sinar UV, loading buffer, DNA sampel dan DNA standar.

Penentuan suhu dalam PCR diperlukan untuk menghentikan reaksi enzimatik dan memisahkan DNA rantai ganda menjadi rantai tunggal.

Kesimpulan :

Dari percobaan yang telah dilakukan dan pembahasan diatas dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut:

1.      Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing.

2.      PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap.

3.      Tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

·         Tahap peleburan (melting) atau denaturasi.

·         Tahap penempelan atau annealing.

·         Tahap pemanjangan atau elongasi.

4.      Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular.

Daftar Pustaka:

Jusuf, Muhammad, 2001, Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen, IPB, Bandung.

Prasetyoputri, Anggia, 2005, Bengkel Ilmu Genetik oleh Martin Brookes, Erlangga, Jakarta.

Sutomo,  Juanda, 2002, Genetika Lanjutan Universitas. Erlangga. Jakarta.